Class 2015
PhD Grant: PD/BD/113630/2015
PhD thesis
Fluorescently-labeled DNA Probes Functionalized onto Gold Nanorods for Signal Enhancement of Nucleic Acids’ Detection
Supervisors
• Pedro M. Paulo, Research Scientist @ IST/ULisboa, PT
• Duarte Miguel F. Prazeres, Professor @ IST/ULisboa, PT
Collaborator
• Peter Zijlstra, Professor @ Technical University of Eindhoven, NL
PhD degree complete: Discussion on November 18, 2020, Pass with distinction
THESIS ABSTRACT
Biosensors are fundamental tools in several areas of our contemporary society, including medicine and healthcare, being useful in diagnostics and therapeutics, as they provide the detection of disease biomarkers. In particular, the field of nanomedicine, in which nanotechnology is applied to biotechnology and medicine, may contribute to the development of innovative biosensors that in a near future will fulfill the demand for diagnostic tests towards point-of-care testing. This will create significant solutions and improvements upon the general public healthcare.
The present doctoral thesis was developed in this scientific and technological context. Thus, a contribution is given toward this collective effort in the field of nanobiosensors with research studies on fluorescently-labeled DNA probes conjugated onto gold nanoparticles. These nanohybrid sensors were envisioned for improved detection of nucleic acids proposed in the literature as disease biomarkers. The fluorescence signalling is based on artificial DNA hairpin probes known as molecular beacons, and the role of the metal particle is more than that of a nano-scaled platform, as it can act as an optical antenna and induce large enhancements in the dye’s emission. The research work was mostly dedicated to the evaluation of the emission enhancement of dye-labeled DNA probes by the antenna effect of the gold nanoparticles, in order to achieve amplification of the optical signal in fluorescence-based sensors. Detailed studies of the enhancement effect were performed by confocal fluorescence microscopy with single-molecule sensitivity and combined with single-particle spectroscopy. The experiments afforded top enhancements of two and three orders of magnitude for the emission of red-emitting dyes, induced, respectively, by one gold nanorod or, alternatively, by one dimer of gold nanospheres. Afterward, the surface functionalization of gold nanorods was optimized through the validation of a method for loading dye-labeled DNAs specifically onto the nanorods’ tips. This ensured effective emission enhancement in the nanohybrids of about one order of magnitude, while indiscriminate surface coating led to undesired emission quenching, as measured in a macroscopic volume by steady-state fluorescence spectroscopy. For the creation of the nanohybrid sensors, various model systems based on molecular beacons were explored and tested in conjugation with gold nanorods. The molecular beacons were designed to function based on a variation on the efficiency of the resonance energy transfer process by the Förster mechanism (FRET) prompted by changes in the hairpin conformation. The selected donor-acceptor pair consisted of the dye Atto-647N and the quencher molecules DDQ II and QSY 21. Preliminary assays were performed with synthetic RNA and DNA targets, whose sequences were proposed in the literature for medical diagnostics of infectious diseases, such as dengue and sleeping sickness, and also a sequence of a microRNA proposed for diagnostics of cancer and/or cardiovascular diseases. The limited response of these molecular beacons in the targets’ recognition led to the development of a novel hairpin probe that employs the gold nanorod itself as an energy acceptor. The tip-functionalization of nanorods with this new probe was successfully performed, but exploratory tests with the nanohybrids resulted until now on a target fluorescence signalling below the expectations. The conjugation of DNA hairpin probes revealed to be a challenging path, but mainly a stimulating and promising one, for it is expected to contribute to new opportunities in the application of the nanohybrid sensors in point-of-care tests for medical diagnostics purposes.
RESUMO DA TESE
Os biosensores são ferramentas fundamentais em várias áreas da nossa sociedade contemporânea, incluindo na medicina e nos cuidados de saúde, sendo úteis em diagnóstico e em terapêutica ao providenciarem a deteção de biomarcadores associados a doenças. Em particular, a área da nanomedicina, na qual a nanotecnologia é aplicada à biotecnologia e à medicina, poderá contribuir para o desenvolvimento de biosensores inovadores que num futuro próximo virão a colmatar a necessidade de testes de diagnóstico para análises no ponto de atendimento (ou POC do acrónimo em inglês). Esta abordagem representará uma melhoria significativa nos cuidados de saúde prestados à generalidade da população. Foi neste contexto científico e tecnológico que a presente tese de doutoramento foi desenvolvida. É assim dada uma contribuição para este esforço coletivo na área de nanobiosensores através da investigação de sondas fluorescentes de DNA conjugadas com nanopartículas de ouro. Estes sensores nanohíbridos foram idealizados para melhorar a deteção de ácidos nucleicos propostos na literatura como biomarcadores associados a doenças. A sinalização por fluorescência é baseada em sondas artificiais de DNA em gancho (ou hairpin) conhecidas como faróis moleculares (molecular beacons). A função da partícula metálica, por sua vez, extravasa a de uma simples plataforma à nano-escala, dado que esta pode atuar como antena ótica e induzir intensificações elevadas na emissão do corante fluorescente. O trabalho de investigação foi dedicado principalmente à avaliação da intensificação da emissão de sondas fluorescentes de DNA pelo efeito antena das nanopartículas de ouro, de modo a alcançar a amplificação do sinal ótico em sensores baseados na fluorescência. Estudos detalhados do efeito de intensificação foram realizados por microscopia confocal de fluorescência com sensibilidade para molécula individual e em combinação com espectroscopia de partícula única. As experiências revelaram intensificações máximas de duas e três ordens de grandeza para a emissão de corantes fluorescentes na gama do vermelho induzidas, respetivamente, por um nanobastonete de ouro ou, em alternativa, por um dímero de nanoesferas de ouro. Posteriormente, foi otimizada a funcionalização da superfície de nanobastonetes de ouro através da validação de um método para colocar sondas fluorescentes de DNA especificamente nas extremidades de nanobastonetes. Isto assegurou uma intensificação efetiva da emissão dos nanohíbridos em cerca de uma ordem de grandeza, enquanto o revestimento indiscriminado da superfície levou a uma indesejada supressão da emissão, tal como medido num volume macroscópico por técnicas de espectroscopia de fluorescência em estado estacionário.
Para a criação dos sensores nanohíbridos foram explorados e testados vários sistemas modelo baseados em faróis moleculares conjugados com nanobastonetes de ouro. Os faróis moleculares foram desenhados para operar com base numa mudança na eficiência do processo de transferência de energia em ressonância pelo mecanismo de Förster (FRET) desencadeada por alterações na conformação do hairpin. O par doador-aceitante selecionado consistiu no corante Atto-647N e nas moléculas supressoras DDQ II ou QSY 21. Os ensaios preliminares foram realizados com alvos de RNA ou DNA sintéticos cujas sequências foram propostas na literatura para o diagnóstico médico de doenças infeciosas, tais como o dengue e a doença do sono, e ainda uma sequência de um microRNA proposto para o diagnóstico do cancro e/ou doenças cardiovasculares. A resposta limitada destes faróis moleculares no reconhecimento dos alvos conduziu ao desenvolvimento de uma nova sonda em gancho que emprega o próprio nanobastonete de ouro como aceitante de energia. A funcionalização seletiva dos nanobastonetes com esta nova sonda foi desenvolvida com sucesso. No entanto, os testes preliminares com os nanohíbridos resultaram até agora numa sinalização do alvo que ficou aquém das expectativas. A conjugação de sondas de DNA em gancho revelou-se por isso um percurso desafiante, mas, acima de tudo, estimulante e promissor, dado que é esperado que possa vir a contribuir para novas oportunidades na aplicação dos sensores nanohíbridos em testes no ponto de atendimento para efeitos de diagnóstico médico.
PUBLICATIONS
Papers
Oliveira-Silva R., Sousa-Jerónimo M., Botequim D., Silva N. J. O., Paulo P. M. R., Prazeres D. M. F., Monitoring Proteolytic Activity in Real Time: A New World of Opportunities for Biosensors, Trends in Biochemical Sciences, 45 (7), 2020.
Botequim D., Silva I. I. R., Serra S. G., Melo E. P., Prazeres D. M. F., Costa S. M. B. and Paulo P. M. R., Fluorescent Dye Nano-Assemblies by Thiol Attachment Directed to the Tips of Gold Nanorods for Effective Emission Enhancement, Nanoscale, 12 (11), 6334-6345, 2020.
Oliveira-Silva R., Sousa-Jerónimo M., Botequim D., Silva N. J., Prazeres D.M.F., Paulo P. M. R., Density Gradient Selection of Colloidal Silver Nanotriangles for Assembling Dye-Particle Plasmophores, Nanomaterials, 9(6), 893, 2019.
Francisco A. P., Botequim D., Prazeres D. M. F., Serra V. V., Costa S. M. B., Laia C. A. T., Paulo P. M. R., Extreme Enhancement of Single-Molecule Fluorescence from Porphyrins Induced by Gold Nanodimer Antennas, Journal of Physical Chemical Letters, 10 (7), 1542-1549, 2019.
Paulo, PMR, Botequim, D, Jóskowiak, A, Martins, S, Prazeres, DMF, Zijlstra, P, Costa SMB, “Enhanced Fluorescence of a Dye on DNA-Assembled Gold Nanodimers Discriminated by Lifetime Correlation Spectroscopy”, Journal of Physical Chemistry C, 122 (20), 10971–10980, 2018.
Oral Communications
Botequim, D., Jóskowiak, A., Martins, S.A.M., Prazeres, D.M.F., Costa, S.M.B., Paulo, P.M.R., “Functionalized gold nanoparticles for plasmonic biosensing of nucleic acids”, MicroBiotec2015, December 10-12, 2015, Évora, Portugal
Botequim D., Prazeres D. M. F., Costa S. M. B., Paulo P M. R., “Fluorescence Enhancement of Labeled Oligonucleotides Using Plasmonic Gold Nanorods Toward Biosensing Applications”, nanoPT2018 International Conference, February 7-9, 2018, Lisboa, Portugal
Botequim D., Silva I. I. R., Prazeres D. M. F., Costa S. M. B., Paulo P.M R., “Tip-selective functionalization of colloidal gold nanorods with fluorescently-labeled DNA’s: optimizing antenna effects”, 6th Nano Today Conference, June, 16-20, 2019, Lisboa, Portugal.
Botequim D., Silva I. I. R., Prazeres D. M. F., Costa S. M. B., Paulo P.M R.,” Tip-selective functionalization of gold nanorods with dye-labeled DNA’s for effective fluorescence enhancements”, NanoSpain2019, May, 28-31 2019, Barcelona, Spain,
Poster Communications
Paulo, P.M.R., Botequim, D., Jóskowiak, A., Martins, S.A.M., Prazeres, D.M.F., Zijlstra, P., Costa, S.M.B., “Plasmon-Enhanced Fluorescence Using DNA-Assembled Gold Nanoparticle Dimers”, 14th IUVSTA Nano-Optics School, Braga, Portugal, April 2016
Paulo, P.M.R., Botequim, D., Jóskowiak, A., Martins, S.A.M., Prazeres, D.M.F., Zijlstra, P., Costa, S.M.B., “Plasmon-Enhanced Fluorescence Using DNA-Assembled Gold Nanoparticle Dimers”, Vth Spanish-Portuguese Conference on Photochemistry, Toledo, Spain, September 2016
Paulo P. M. R., Botequim D., Eskandari Z., Prazeres D. M. F., Zijlstra P., Costa S. M. B., “Site-selective Functionalization of Hot-spots for Plasmonic Biosensing”, NaNaX 8 — Nanoscience with Nanocrystals, July 3-7 2017, Braga, Portugal
Botequim D., Prazeres D. M. F., Costa S. M. B., Paulo P M. R., “Gold Nanorods Conjugated with Fluorescently-Labeled DNA’s: Highly Loaded Dye-Nanoparticles”, Noble Metal Nanoparticles Gordon Research Conference, 17 – 22 June 2018, Massachusetts, USA
Botequim D., Jóskowiak A., Prazeres D. M. F., Costa S. M. B., Paulo P M. R., “Gold Nanorods Functionalized with Fluorescently-Labeled DNA’s: a Single-Particle Spectroscopy Study”, 6 JIF – Jornadas Ibéricas de Fotoquímica, 11-14 September 2018, Aveiro, Portugal
DOCTORAL PROGRAM (36 ECTS)
Curricular Units:
• General Doctoral Training (6ECTS)
• Advanced Experimental Techniques and methodologies (6ECTS)
• Bioentrepreneurship (6 ECTS)
• Advanced Topics in Bioengineering and Biosciences (6ECTS)
• Outreach and Teaching Skills (6ECTS)
• Surfaces, Interfaces and Colloids (6ECTS)
Current position
Researcher @ Center for Strutural Chemistry, Instituto Superior Técnico, Av. Rovisco Pais, 1049-001 Lisboa, Portugal